細胞培養(yǎng)過程和過程因細胞類型和應(yīng)用而異。 我們需要意識到，如果不以適合每個過程的方式處理細胞，它們的特征可能會改變。 本節(jié)介紹了一般細胞培養(yǎng)過程和程序，同時指出了要考慮的重要點。

細胞培養(yǎng)細胞的制備

圖：廣義細胞培養(yǎng)過程的流程圖

有兩種用于獲取細胞的方法：從細胞庫或從供體組織中隔離細胞。 當(dāng)從細胞庫中獲得的細胞開始培養(yǎng)時，需要經(jīng)過“解凍”，“細胞播種”和“細胞觀察”的程序。

當(dāng)使用從供體收集的組織時，如果附著的話，通常會去除不必要的組織。 有兩種主要方法可以將細胞與組織，外植體培養(yǎng)和酶促方法分離。 在酶促方法中，使用蛋白水解酶溶液從感興趣的組織中分離細胞。 如果使用酶，請用酶反應(yīng)抑制劑稀釋酶或停止酶反應(yīng)，然后繼續(xù)進行“細胞播種”和“細胞觀察”的步驟，以準(zhǔn)備細胞培養(yǎng)。

解凍

解凍冷凍的冷凍保存細胞啟動細胞培養(yǎng)，可能被認(rèn)為是“喚醒細胞”。 從細胞庫中獲得的一瓶冷凍細胞從液體氮氣罐*1或低溫深冰箱（-150°C）轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)睦洳厝萜?，例如液態(tài)氮容器，轉(zhuǎn)運到長凳上，并融化并融化 在37°C的水浴或熔化設(shè)備中*2。 在冰幾乎融化之前，迅速添加培養(yǎng)基以稀釋冷凍保護劑液體（例如DMSO），通過離心將細胞沉淀出來，并在去除上清液后，添加了預(yù)先加熱到37°C的上清液后。 然后通過移液重懸于細胞，并使用顯微鏡或細胞計數(shù)器測量細胞/細胞濃度的數(shù)量。

*1：有兩種方法可以在液氮罐中冷凍和保存細胞：使用液氮的冷氣，“蒸氣相”，“液相”，其中冷凍保存的物體直接浸入液氮中。 在液態(tài)相的情況下，可以將其保存在-196°C，即液氮的溫度，但液氮進入冷凍的小瓶并用細菌，酵母，酵母，肉芽腫，分生孢子，，菌質(zhì)，分枝菌，，有液氮的風(fēng)險很高。 和其他小瓶的病毒。 因此，強烈建議在蒸氣相中存儲。

*2：如果將其儲存在液相中的小瓶被放置在37°C的水浴中，或者將液氮保留在小瓶中的熔融設(shè)備中，則可能會破裂。 蓋子應(yīng)松開一次并重新固定，然后將其放在37°C的水浴中。

細胞播種

為了達到目標(biāo)細胞播種密度，請根據(jù)測量的細胞數(shù)量計算實現(xiàn)所需細胞播種密度所需的新鮮培養(yǎng)基量，并相應(yīng)地稀釋細胞懸浮液。

細胞觀察

在新培養(yǎng)容器中播種細胞后，以以下方式觀察具有光學(xué)顯微鏡或其他觀察裝置的血管中的細胞：

檢查是否有可行的單元格

檢查以確保細胞均勻分布在容器中

檢查除細胞以外的異物是否存在

檢查細胞形態(tài)

確認(rèn)上述內(nèi)容后，將細胞培養(yǎng)容器放在37°C的加濕二氧化碳孵化器中，然后開始培養(yǎng)。

從細胞培養(yǎng)開始到通道

細胞觀察

將細胞播種在新的培養(yǎng)容器中，該血管置于二氧化碳培養(yǎng)箱中。 通常，在第二天*，使用光學(xué)顯微鏡或其他觀察裝置進行以下觀測值：

檢查以確保培養(yǎng)容器中的細胞以外沒有其他異物

確定培養(yǎng)物是否正常通過檢查細胞形態(tài)和狀況*，在某些情況下，根據(jù)培養(yǎng)條件和細胞類型，在某些情況下它們可以持續(xù)兩天。

中型交換

在培養(yǎng)容器中解凍并播種后，細胞開始在二氧化碳孵化器中生長。 細胞將培養(yǎng)基中的營養(yǎng)代謝，因此必須用新鮮培養(yǎng)基代替已耗盡營養(yǎng)并富含代謝物的培養(yǎng)基。 此過程稱為“中等變化”或“中等替代”。

在介質(zhì)變化之前，首先觀察細胞以驗證培養(yǎng)物正在正常進行。 去除舊介質(zhì)后，迅速添加新培養(yǎng)基以防止細胞干燥。 如果不浸入培養(yǎng)基，有些細胞可能會死亡，因此在某些情況下，少量的舊培養(yǎng)基被剩下而不是完全丟棄。 此外，應(yīng)將新鮮培養(yǎng)基預(yù)熱至37°C，以免使細胞暴露于溫度突然變化。

更改介質(zhì)后，檢查細胞是否有損壞的跡象。 使用顯微鏡獲取文化圖像，以記錄其進行得很好的過程，然后將其歸還給孵化器，以便小心減少不必要的干擾。

通道

一旦細胞開始增殖，在當(dāng)前血管飽滿之前，將它們分成新的培養(yǎng)容器。 這稱為“通道”。 細胞種植以填充培養(yǎng)容器的狀態(tài)稱為“匯合”。 通常，建議當(dāng)細胞占據(jù)的區(qū)域達到約70％至80％的血管時，建議將細胞轉(zhuǎn)移。

當(dāng)它們變成匯合時，細胞彼此接觸，并感到它們不再需要生長，這是一種稱為“接觸抑制”的現(xiàn)象，尤其是在正常細胞的情況下，它們在通過后將不再增殖。 就癌細胞而言，它們將繼續(xù)迅速增殖，但它們將缺乏營養(yǎng)，因此允許它們匯合不好是不好的。 因此，有必要觀察和監(jiān)測細胞生長。

懸浮細胞和粘附細胞之間的通道方法不同。

懸浮電池的通過

將細胞培養(yǎng)物懸浮液收集到管中，然后離心以收集細胞。 卸下上清液，留下細胞顆粒，然后在新鮮的培養(yǎng)基中重新懸浮。 采用新鮮懸浮液的一部分，涂上重要的染色錐形藍色，并計算活細胞的數(shù)量。 計算細胞濃度，考慮細胞稀釋方法，適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)懸浮液中的細胞密度，然后放置在新容器中。

粘附細胞的通過

粘附在培養(yǎng)容器表面的細胞需要以某種方式與其表面分離。 通常，使用膠原酶，分配和胰蛋白酶等蛋白酶。 在胰蛋白酶的情況下，鈣或鎂離子會抑制活性，因此有必要在施用這些離子之前清洗含有這些離子的培養(yǎng)基。 相反，在鈣離子存在下，膠原酶和分散酶顯示出活性。

一般過程如下：

去除舊培養(yǎng)基上清液

如有必要，用磷酸鹽緩沖液或新鮮培養(yǎng)基洗滌

添加細胞分散酶溶液

在酶的活動范圍內(nèi)的預(yù)定溫度穩(wěn)定預(yù)定時間，以促進酶促反應(yīng)

檢查顯微鏡下的細胞脫離程度

通過輕度機械障礙（例如竊聽等）促進細胞脫離。

如果可以使用酶的停止溶液，請?zhí)砑铀酝Ｖ狗磻?yīng)。 如果沒有，請?zhí)砑有迈r培養(yǎng)基以稀釋酶并減少活性

移液管幾次將細胞分離為單細胞懸浮液

收集包括細胞在內(nèi)的培養(yǎng)基，通過離心沉淀細胞，并去除含有酶和反應(yīng)停止溶液的上清液。

點擊管子松開細胞顆粒

在收集的細胞管中添加新鮮培養(yǎng)基

通過上下移動來重懸機

準(zhǔn)備樣品作為代表性的細胞懸浮液來計算細胞數(shù)/細胞密度

使用帶有血細胞計或自動細胞計數(shù)器的顯微鏡計數(shù)細胞數(shù)

確定正確稀釋以獲得所需的細胞密度，添加適當(dāng)量的新鮮培養(yǎng)基，然后重新降低細胞

播種預(yù)定量的細胞懸浮液中的新培養(yǎng)容器

執(zhí)行顯微鏡觀察

轉(zhuǎn)移到加濕的CO2孵化器，設(shè)置為37°C的溫度

但是，如果使用分散酶，某些細胞可能會削弱。 在這種情況下，用刮刀機械刮擦并剝離細胞，或者用從移液器到收獲細胞的流量將細胞剝離。

細胞培養(yǎng)后加工（庫存準(zhǔn)備）

重要的是要制作具有與原始單元相同特征的股票，該股票可以從供應(yīng)商購買或從其他地方轉(zhuǎn)移的原始培養(yǎng)物獲得。 這是因為細胞是活物質(zhì)，其特征可能會隨著時間的流逝而變化，如果長時間延續(xù)，則可能導(dǎo)致它們與原始細胞不同。

可以創(chuàng)建細胞庫存如下：

細胞觀察

使用光學(xué)顯微鏡或其他觀測設(shè)備執(zhí)行以下觀察結(jié)果。

檢查培養(yǎng)容器中的細胞以外的其他異物

確定細胞是否是亞匯合物，并且沒有過度增長

通過檢查細胞形態(tài)和狀況來確定培養(yǎng)是否正常進行

細胞脫離

使用前面描述的通道程序收集庫存的細胞。

細胞觀察

添加新鮮的培養(yǎng)基通過離心重懸于收集的細胞，但使用少量培養(yǎng)基，因為細胞懸浮液的密度需要高于通過的介質(zhì)。 細胞通過移液懸浮，并使用顯微鏡或測量儀器測量細胞/細胞密度的數(shù)量。

分配

將細胞懸浮液調(diào)節(jié)到所需的細胞數(shù)量，添加相同數(shù)量的2倍濃縮的冷凍保存溶液，然后通過移液重新懸浮。 在不斷移動或不斷攪拌的同時，將預(yù)定量的溶液分配到冷凍管中。

凍結(jié)

冷凍管應(yīng)立即放置在冰箱容器中，并放入深冰箱（-80°C）中，以保持每分鐘-1°C的冰點。 或者，使用可編程的控制率冰柜凍結(jié)。 細胞冷凍后，冷凍的冷凍管應(yīng)在液氮儲罐或低溫深冰箱（-150°C）中存儲在蒸氣相。 但是，過程取決于冷凍保存解決方案的類型。

確認(rèn)

解凍一兩個冷凍的小瓶和培養(yǎng)它們。 確認(rèn)細胞是否可以以相同的方式生長并表現(xiàn)出與以前幾乎相同的特征。 確認(rèn)這一點后，停止細胞培養(yǎng)。

開始實驗

根據(jù)需要解凍準(zhǔn)備的細胞庫存。 經(jīng)過一定的培養(yǎng)時間，應(yīng)將細胞丟棄并解凍新鮮庫存。