在體內(nèi)，細(xì)胞受到高度進(jìn)化和復(fù)雜的免疫系統(tǒng)的保護(hù)。一旦從組織中分離出來(lái)，培養(yǎng)中的細(xì)胞就 "自生自滅"。因此，我們必須用謹(jǐn)慎的無(wú)菌技術(shù)來(lái)保護(hù)它們，以防止它們被存在于我們周圍，包括實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的微生物所污染。

存在各種類型的污染：例如，細(xì)胞可能被細(xì)菌、支原體或霉菌所污染。其中一些比其他的更難發(fā)現(xiàn)（如支原體），因此會(huì)在你不知不覺中對(duì)你的結(jié)果產(chǎn)生巨大影響。其他的會(huì)很明顯，會(huì)迫使你中斷你的實(shí)驗(yàn)--這就浪費(fèi)了時(shí)間、精力和金錢。實(shí)驗(yàn)室里的污染對(duì)科學(xué)家來(lái)說(shuō)可能是一場(chǎng)噩夢(mèng)，特別是它們可以從一個(gè)樣品擴(kuò)散到存在于同一培養(yǎng)箱或罩子里的所有其他樣品。因此，對(duì)于實(shí)驗(yàn)室的每個(gè)人來(lái)說(shuō)，盡可能地小心謹(jǐn)慎是一項(xiàng)重要的責(zé)任，不僅是為了他們自己的實(shí)驗(yàn)，也是為了其他人的實(shí)驗(yàn)。

防止污染的措施有很多，應(yīng)該在整個(gè)處理過(guò)程中應(yīng)用。隨著經(jīng)驗(yàn)的積累，這些措施已成為第二天性，但仍然很容易犯不自覺的錯(cuò)誤。雖然細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域正朝著更高的自動(dòng)化水平發(fā)展2，部分原因是為了防止細(xì)胞污染，但到今天為止，我們?nèi)匀恢饕揽渴止趧?dòng)，這為無(wú)菌處理提供了許多犯錯(cuò)的機(jī)會(huì)，特別是對(duì)初學(xué)者來(lái)說(shuō)。在此，我們提供一些必要的提示，以保持無(wú)菌環(huán)境，防止細(xì)胞培養(yǎng)污染。

1.戴手套，實(shí)驗(yàn)室涂層并使用引擎蓋

毋庸置疑，您必須在細(xì)胞與您的實(shí)驗(yàn)室（或?qū)嶋H上您自己）之間提供障礙。 使用手套，實(shí)驗(yàn)室涂層和引擎蓋就是這樣做的。 僅在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用實(shí)驗(yàn)室，并經(jīng)常清潔它們。 確保經(jīng)常維修引擎蓋，以確保其正常工作。 請(qǐng)注意，有不同類型的引擎蓋，具體取決于您想要的細(xì)胞和用戶的保護(hù)水平。

2.正確使用引擎蓋

擁有引擎蓋不足以確保無(wú)菌環(huán)境：您必須正確使用它。 首先，確保您不會(huì)阻止引擎蓋內(nèi)的空氣流：請(qǐng)勿將材料放在空氣插座或經(jīng)常在引擎蓋內(nèi)部長(zhǎng)凳空間的前后發(fā)現(xiàn)的空氣插座或入口上。 此外，請(qǐng)確保您在引擎蓋內(nèi)部工作良好，并且不太靠近邊緣，以確保您實(shí)際上在無(wú)菌條件下運(yùn)行。 您可能需要在一天結(jié)束時(shí)清空引擎蓋，并確保在每次使用前后都用70％的乙醇或70％的IMS擦除它。 一些小組選擇在引擎蓋內(nèi)有廢物處理垃圾箱，如果這樣做，將其清空并經(jīng)常清潔。 其他人則寧愿不這樣做，并將其放在引擎蓋外面，因?yàn)樵谝嫔w內(nèi)使用了很長(zhǎng)時(shí)間使用材料或試劑會(huì)增加污染的風(fēng)險(xiǎn)。 最后，引擎蓋通常帶有紫外線光：在一天結(jié)束時(shí)打開它，以在不使用罩時(shí)對(duì)引擎蓋進(jìn)行消毒。

3.定期清潔孵化器和水浴

一些新的孵化器具有自我清潔能力 - 其他孵化器必須手動(dòng)清潔。 經(jīng)常這樣做； 該協(xié)議將根據(jù)孵化器而變化。 如果您在孵化器內(nèi)使用一盤水，請(qǐng)經(jīng)常更換水。 您有時(shí)可能需要在水中添加化學(xué)物質(zhì)以防止污染（始終檢查該化學(xué)物質(zhì)是否與托盤制成的材料兼容）。 同樣，您的水浴中的水應(yīng)定期更換媒體。 每次更改時(shí)，都要添加水浴處理。

4.用乙醇或IMS噴灑所有東西

乙醇通常用于殺死細(xì)菌。 確保使用70％的乙醇與水混合，而不是濃度較低。 已知水會(huì)增加乙醇在殺死細(xì)菌和一些病毒中的功效。 用乙醇噴灑您的手套和帶動(dòng)引擎蓋的所有東西。 重要的是要意識(shí)到，每當(dāng)您觸摸引擎蓋之外的東西時(shí)，都應(yīng)該再次噴上手套，然后將其放回引擎蓋中。 這適用于可能沒(méi)有引起注意的自動(dòng)主義，例如移動(dòng)椅子，將東西扔到引擎蓋外或觸摸眼鏡。 購(gòu)買防乙醇標(biāo)記來(lái)標(biāo)記您的實(shí)驗(yàn)室，否則將乙醇噴灑在上面可以消除您的標(biāo)簽。

5.最大程度地減少細(xì)胞暴露于非疾病環(huán)境

由于付出了很大的努力，致力于維持孵化器和引擎蓋內(nèi)部的無(wú)菌環(huán)境，因此請(qǐng)確保您最大程度地減少了細(xì)胞在這些環(huán)境之外的時(shí)間。 例如，當(dāng)您在顯微鏡下檢查它們時(shí)，或?qū)⑺鼈儚姆趸鬓D(zhuǎn)移到引擎蓋時(shí)。 如果您必須在非緊密的條件下長(zhǎng)時(shí)間使用細(xì)胞，例如在延時(shí)成像期間，并且需要將細(xì)胞重新放回孵化器中，請(qǐng)?jiān)诳赡艿那闆r下為此目的指定單獨(dú)的孵化器。 這樣，增加的污染風(fēng)險(xiǎn)將僅限于一個(gè)孵化器。

6.購(gòu)買無(wú)菌試劑并保持無(wú)菌！

確保購(gòu)買無(wú)菌的試劑。 這包括媒體，PBS或任何其他將與細(xì)胞接觸的產(chǎn)品。 如果您將試劑用于其他未無(wú)菌的作品，例如抗體，請(qǐng)不要將其用于細(xì)胞培養(yǎng)。 保留兩種單獨(dú)的無(wú)菌和非菌株試劑。 此外，您還可以選擇通過(guò)去除細(xì)菌的膜過(guò)濾培養(yǎng)基（或任何其他液體試劑）。 通常，0.2μm過(guò)濾器足以阻斷細(xì)菌。 維持試劑無(wú)菌性的另一種方法是將其等分。 這樣，如果一個(gè)等分試樣被污染了整個(gè)股票，則不受影響，您可以丟棄一個(gè)等分試樣而不是整個(gè)股票。 您也可以購(gòu)買預(yù)級(jí)試劑。

7.使用無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室

除了試劑外，您還必須對(duì)細(xì)胞接觸的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行消毒。 為了對(duì)其進(jìn)行消毒，您可以使用高壓鏟機(jī)。 但是，請(qǐng)確保您的實(shí)驗(yàn)室可以被高壓滅菌！ 并非所有材料都能維持高壓釜的溫度。 例如，科學(xué)家經(jīng)常進(jìn)行高壓滅絕移液器或移液器提示。 如果可以的話，購(gòu)買已經(jīng)無(wú)菌的消耗品，例如燒瓶。 為了保持不育，只有將燒瓶袋噴涂并將其噴涂并將其放入引擎蓋中。 完成后，將袋子在引擎蓋內(nèi)關(guān)閉，然后再將其帶回外面。 如果用膠帶將袋子密封，并且膠帶在引擎蓋外，請(qǐng)用手將袋子閉合，直到膠帶膠帶為止。 如果您的實(shí)驗(yàn)室中有過(guò)濾水的來(lái)源，也可以自壓水。 將壓力敏感的膠帶放在材料上之前，將其放在高壓滅菌器中：如果材料成功地被高壓滅菌和消毒，則膠帶應(yīng)更換顏色。

8.經(jīng)常使用并更換濾芯吸頭

包含過(guò)濾器的移液尖端阻止尖端內(nèi)部的溶液接觸移液器。 如果沒(méi)有過(guò)濾尖端，您的移液可能會(huì)被污染，從而污染其首先接觸的其他所有樣品，這意味著，如果一個(gè)樣品被微生物污染，則可以擴(kuò)散到其他樣品中，但這也可能意味著您可以非自愿地從一個(gè)樣品中引入細(xì)胞 樣本到另一個(gè)。 出于同樣的原因，請(qǐng)確保在實(shí)驗(yàn)期間經(jīng)常更改技巧，尤其是在樣品之間。 當(dāng)您使用移液器操作時(shí)，請(qǐng)小心，以免將 移液器吸頭與其他任何東西直接接觸，如果您確實(shí)更換了吸頭。 重要的是，如果您想從瓶子里放東西，請(qǐng)避免使用必須在瓶中插入的移液器，以防止移液器直接觸摸瓶子的內(nèi)部：而是使用可以使用更長(zhǎng)的移液槍 可以在瓶子內(nèi)部深入的移液。

9.經(jīng)常檢查細(xì)胞

即使某些污染（例如與支原體相關(guān)的污染）很難在視覺上檢測(cè)到，但在顯微鏡下定期檢查細(xì)胞始終是明智的。 如果這樣做，請(qǐng)盡量不要將細(xì)胞遠(yuǎn)離孵化器，以最大程度地減少污染風(fēng)險(xiǎn)。 您可以檢查運(yùn)動(dòng)細(xì)菌（不要與細(xì)胞碎片混淆！），形態(tài)變化或異常增殖率。 如果您懷疑您的樣品被支原體污染，則可以使用商業(yè)套件來(lái)確認(rèn)這一點(diǎn)。

10.漂白您的污染樣品

如果您確實(shí)認(rèn)為樣品被污染了，請(qǐng)?jiān)谒壑刑畛?0％的漂白劑，三角洲或克洛斯，或者遠(yuǎn)離孵化器一段時(shí)間。 將其倒入水槽內(nèi)，扔掉文化船。 如果您意識(shí)到樣品被污染了，請(qǐng)警告您的Labmates，尤其是那些在同一孵化器中有樣品的人！ 這確實(shí)很重要，它可以讓他們迅速做出反應(yīng)，檢查樣本是否正常，并相應(yīng)地計(jì)劃。 如果可以清空其所有樣品的孵化器，請(qǐng)清潔孵化器。

11.使用良好的標(biāo)簽練習(xí)

保留細(xì)胞補(bǔ)充劑和媒體庫(kù)存的良好記錄將幫助您更快地識(shí)別污染源。 如果發(fā)現(xiàn)某些單元被污染，則應(yīng)能夠識(shí)別這些單元所屬的庫(kù)存并測(cè)試污染是否對(duì)整個(gè)庫(kù)存是共同的。 同樣，如果您知道所使用的媒體或補(bǔ)充劑，則可以檢查或扔掉受影響的股票以避免重復(fù)污染。 良好的標(biāo)簽還可以防止其他細(xì)胞類型對(duì)實(shí)驗(yàn)污染：您想確保在測(cè)定中所擁有的單元格是您認(rèn)為它們的細(xì)胞。 這是該領(lǐng)域的一個(gè)巨大問(wèn)題，使用錯(cuò)誤的細(xì)胞系進(jìn)行了多達(dá)30,000個(gè)研究。4。 因此，請(qǐng)確保正確標(biāo)記所有燒瓶和小瓶，以最大程度地減少樣品之間交叉污染的可能性。

12.常識(shí)

最后但并非最不重要的一點(diǎn)是，常識(shí)可以防止污染。 例如，請(qǐng)勿在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室中使用細(xì)菌或霉菌進(jìn)行工作。 不用說(shuō)，不應(yīng)在細(xì)胞培養(yǎng)孵化器中放置任何包含細(xì)菌的樣品。 如果您生病了，請(qǐng)盡量避免繼續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)工作。 最小化在開放式孵化器面前或在引擎蓋上工作時(shí)交談。 不要將孵化器門打開太久。 在細(xì)胞文化處理前后，洗手！