當(dāng)您剛畢業(yè)并進(jìn)入工作時(shí)，與一堆名詞面對(duì)的實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)接觸，您是否對(duì)從哪里開始感到困惑？ 放大曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線，閾值，CT值，熔解曲線和基線的含義是什么？ 那些實(shí)驗(yàn)的熒光圖像太亮了，但我似乎無(wú)法識(shí)別它們。 今天，我們將帶您分兩個(gè)部分學(xué)習(xí)這些知識(shí)和概念：專業(yè)術(shù)語(yǔ)和常見問(wèn)題。

第一部分專業(yè)條款

1.擴(kuò)增曲線

放大曲線是指曲線，其中循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)和反應(yīng)期間的實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度為PCR過(guò)程中的縱坐標(biāo)。

2.基線

基線指的是，在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的前幾個(gè)周期中，熒光信號(hào)幾乎沒有變化。 信號(hào)級(jí)別顯示接近直線，這種直線是基線。

3.熒光閾值設(shè)置

通常，PCR反應(yīng)的前15個(gè)周期的熒光信號(hào)用作熒光背景信號(hào)，熒光閾值是PCR 3-15個(gè)周期期間熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，并設(shè)置了熒光閾值 在PCR擴(kuò)增的指數(shù)階段。 通常，每個(gè)儀器在使用前都有其熒光閾值。

4. CT值

CT值表示當(dāng)熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)，每個(gè)PCR反應(yīng)管都會(huì)發(fā)生的循環(huán)數(shù)。 從研究中，我們知道每個(gè)模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)之間存在線性關(guān)系。 初始副本編號(hào)越多，CT值越小，反之亦然。 使用具有已知起始副本編號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)，可以制作校準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，而縱坐標(biāo)表示CT值。 因此，只要獲得未知樣品的CT值，就可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算樣品的初始拷貝數(shù)。

知道更多

有幾個(gè)指標(biāo)可以判斷放大曲線是否良好：

答：曲線的拐點(diǎn)很明顯，尤其是低重分樣品的指數(shù)相很明顯，放大曲線的總體平行性很好，基線是平坦的，沒有上升現(xiàn)象，并且低 - 級(jí)的指數(shù)相位 濃度樣品放大曲線很明顯。

B：曲線指數(shù)相的斜率與擴(kuò)增效率成正比，斜率越大，放大效率越高。

C：標(biāo)準(zhǔn)的基線是平坦或略微降低的，沒有明顯的向上趨勢(shì)。

D：每個(gè)管的擴(kuò)增曲線的并行性很好，表明每個(gè)反應(yīng)管的擴(kuò)增效率相似。

5.熔化曲線
當(dāng)PCR產(chǎn)物加熱時(shí)，隨著溫度的升高，雙鏈擴(kuò)增產(chǎn)物逐漸解離，從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低。 當(dāng)達(dá)到一定溫度時(shí)，大量產(chǎn)品分離，導(dǎo)致熒光急劇降低。 使用此功能以及不同PCR產(chǎn)物的不同TM值使熒光信號(hào)迅速下降的溫度也不同，這可能是識(shí)別PCR特異性的好方法。
6.熔化曲線（采用對(duì)數(shù)曲線）
以熔解曲線的對(duì)數(shù)形成峰值圖，以更直觀地顯示產(chǎn)品片段的情況。 由于熔化溫度是DNA片段的TM值，因此可以確定某些影響DNA片段TM值的參數(shù)，例如片段大小，GC含量等。通常，根據(jù)我們的底漆設(shè)計(jì)原理，通常會(huì)說(shuō) 放大產(chǎn)物的長(zhǎng)度在80-300bp的范圍內(nèi)，熔化溫度應(yīng)在80°C和90°C之間。
答：如果在80°C和90°C之間只有一個(gè)主峰，則意味著熒光定量PCR是完美的。
B：如果主峰出現(xiàn)在80°C和90°C之間，并且雜質(zhì)峰出現(xiàn)在80°C以下，則基本上考慮了引物二聚體。 這是一個(gè)不錯(cuò)的選擇，試圖提高退火溫度解決。
C：如果主峰出現(xiàn)在80°C和90°C之間，并且當(dāng)溫度升高時(shí)出現(xiàn)流浪峰，則基本上考慮了DNA污染。 并且需要在實(shí)驗(yàn)的初始階段去除DNA。
7.標(biāo)準(zhǔn)曲線線
將標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)稀釋至不同的濃度，并用作PCR反應(yīng)的模板。 標(biāo)準(zhǔn)曲線以標(biāo)準(zhǔn)拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，將測(cè)量的CT值作為縱坐標(biāo)繪制。 量化未知樣品時(shí)，可以根據(jù)未知樣品的CT值從標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品的拷貝數(shù)。 標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)于絕對(duì)定量非常重要。

第二部分。 常見問(wèn)題

Q1：RT-PCR，QPCR，實(shí)時(shí)PCR和實(shí)時(shí)RT-PCR有什么區(qū)別？

A1：RT-PCR是逆轉(zhuǎn)錄PCR，它是聚合酶鏈反應(yīng)的廣泛使用的變體。 在RT-PCR中，將RNA鏈反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA，然后用作PCR通過(guò)PCR擴(kuò)增DNA的模板。

實(shí)時(shí)PCR和QPCR是同一件事，兩者都是實(shí)時(shí)定量PCR，這意味著PCR過(guò)程中的每個(gè)周期都有數(shù)據(jù)的實(shí)時(shí)記錄。 這樣，可以精確分析啟動(dòng)模板的數(shù)量。

盡管實(shí)時(shí)PCR和逆轉(zhuǎn)錄PCR似乎都可以縮寫為RT-PCR，但國(guó)際公約是RT-PCR專門指的是逆轉(zhuǎn)錄PCR，而實(shí)時(shí)PCR通常被縮寫為qPCR（量化實(shí)際真實(shí)的真實(shí)真實(shí)真實(shí)的真實(shí)PCR）  - 時(shí)間PCR）。

實(shí)時(shí)RT-PCR（RT-QPCR）是一種逆轉(zhuǎn)錄PCR，結(jié)合了熒光定量技術(shù)：從RNA到獲得cDNA（RT）的首次逆轉(zhuǎn)錄，然后使用實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行定量分析（QPCR）。

Q2：為什么在80-300bp的范圍內(nèi)控制熒光定量PCR的放大產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度？

A2：每個(gè)基因序列的長(zhǎng)度不同，其中一些是幾個(gè)Kb和幾百個(gè)BP。 但是，當(dāng)我們?cè)O(shè)計(jì)底漆時(shí)，我們只需要要求產(chǎn)品的長(zhǎng)度為80-300bp，而太短或太長(zhǎng)不適合定量PCR檢測(cè)。

產(chǎn)品片段太短，無(wú)法與引物二聚體區(qū)分開。 引物二聚體的長(zhǎng)度約為30-40bp，當(dāng)它小于80bp時(shí)，很難區(qū)分它是引物二聚體還是產(chǎn)品。 如果產(chǎn)品片段太長(zhǎng)，超過(guò)300bp，這很容易導(dǎo)致放大效率較低，并且無(wú)法有效檢測(cè)基因的量。

例如，當(dāng)您計(jì)算教室里的人數(shù)時(shí)，您只需要計(jì)算有多少個(gè)嘴巴即可。 檢測(cè)基因時(shí)也是如此。 您只需要檢測(cè)一個(gè)基因的某個(gè)序列即可表示整個(gè)序列。 如果您既計(jì)算嘴巴的數(shù)量，又要計(jì)算鼻子，耳朵和眼鏡的數(shù)量以計(jì)算人數(shù)，那么犯錯(cuò)很容易。

Q3：底漆設(shè)計(jì)的最佳長(zhǎng)度是多少？

A3：一般而言，20-24bp范圍內(nèi)的底漆長(zhǎng)度很好。 當(dāng)然，我們必須在設(shè)計(jì)底漆時(shí)注意底漆TM值，因?yàn)樗c最佳退火溫度有關(guān)。 經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)，已經(jīng)證明60℃是一個(gè)很好的TM值。 低退火溫度很容易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，而高退火溫度通常會(huì)導(dǎo)致放大效率低，放大曲線的晚期峰和延遲的CT值。

問(wèn)題4：收集的樣品量會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果嗎？

A4：不。顯然，收集的樣品越多，提取的RNA越多，cDNA越多，目標(biāo)片段就會(huì)越多。 對(duì)于絕對(duì)定量，要計(jì)算目標(biāo)片段的拷貝數(shù)，收集的樣品量肯定會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 例如，檢測(cè)血液中丙型肝炎病毒HBV的是以一定量（1ml）的血液檢測(cè)HBV含量。

對(duì)于科學(xué)研究中通常使用的相對(duì)定量，樣品的數(shù)量與實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)關(guān)，因?yàn)橄鄬?duì)定量是指靶基因與參考基因之間的比較。 只是請(qǐng)認(rèn)為它們是同一核酸鏈中存在的上游和下游片段。 如果樣本量很大，則參考基因和靶基因均以同等比例同時(shí)增加，這不會(huì)影響結(jié)果。

Q5：逆轉(zhuǎn)錄酶的效率會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果嗎？

A5：與上面相同。 請(qǐng)注意，我們希望獲得更高的逆轉(zhuǎn)錄效率，但是我們更渴望逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄效率相對(duì)穩(wěn)定并獲得均勻的結(jié)果。 這將是對(duì)主要公司逆轉(zhuǎn)錄套件的優(yōu)化功能的測(cè)試。

問(wèn)題6：TAQ酶的效率會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果嗎？

A6：TAQ酶的效率相對(duì)較大。 通常，需要熱啟動(dòng)的taq酶，并且效率相對(duì)較高。 對(duì)于商業(yè)熒光定量試劑盒，每個(gè)制造商將根據(jù)自己的產(chǎn)品接近100％的產(chǎn)品來(lái)優(yōu)化最佳狀態(tài)的效率，如果效率太低，則無(wú)法獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 對(duì)于不同公司的產(chǎn)品，這是質(zhì)量的衡量標(biāo)準(zhǔn)。

問(wèn)題7：熒光染料的量會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果嗎？

A7：是的，會(huì)。 如果熒光染料太飽和，則會(huì)引起某些儀器的噪聲干擾。 如果熒光染料未飽和，并且熒光值太低，則它將盡早進(jìn)入高原相，并且放大曲線將是平坦的。 在熒光定量實(shí)驗(yàn)中，主要看到CT值，因此對(duì)于晚期擴(kuò)增曲線而言，進(jìn)入高原階段并不重要，但是該圖不夠美麗。 如果您必須做出選擇，則首先選擇熒光染料稍微不飽和。 但是，當(dāng)使用同一公司的同一產(chǎn)品時(shí)，其效果基本上可以忽略不計(jì)。

問(wèn)題8：PCR管的透射會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果嗎？

A8：是的。 但是，對(duì)于來(lái)自同一制造商的同一批消耗品，可以忽略這種效果。 這是一個(gè)不錯(cuò)的選擇，最好使用帶有高滲透性膜的96孔板來(lái)最大程度地減少消耗品的光透射率的影響。

Q9：操作期間的誤差會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果嗎？

A9：操作過(guò)程的影響主要反映在均勻性中。 均勻性意味著系統(tǒng)中的所有組件均勻混合在一起，瞬時(shí)離心可以解決此問(wèn)題。 此外，對(duì)于初學(xué)者，最好將PCR系統(tǒng)調(diào)整為20英寸以上，而一個(gè)太小的系統(tǒng)更容易出現(xiàn)錯(cuò)誤。 如果正確優(yōu)化退火溫度，則底漆濃度對(duì)CT的影響最小化。 而且您會(huì)知道，可以通過(guò)優(yōu)化退火溫度來(lái)避免一些操作錯(cuò)誤（例如底漆濃度）。

總結(jié)

以上是新手在實(shí)驗(yàn)期間經(jīng)常遇到的一些問(wèn)題和疑問(wèn)，我們希望這些問(wèn)題可以幫助您解決一些困惑。 實(shí)驗(yàn)是產(chǎn)生混亂和解決問(wèn)題的過(guò)程，希望您能從中得到一些東西。 感謝您的閱讀，我們下次會(huì)見您！