聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 和逆轉(zhuǎn)錄定量實時 PCR (RT-qPCR) 是基本的分子技術(shù)，由于它們對特定 DNA 序列或特定 RNA 轉(zhuǎn)錄物或病毒基因組序列的靈敏檢測，已在全球許多實驗室中廣泛使用. 一旦我們了解了這些技術(shù)如何檢測它們的核酸靶標(biāo)，它們在使用的儀器和試劑方面的獨特作用就變得清晰起來。

PCR 分析可以通過以下兩種方式之一進行，或者使用終點 PCR，在測量最終熒光之前完成 PCR 反應(yīng)，或者使用實時 PCR 檢測，在熒光發(fā)生時測量熒光（在“實時熒光”中）。 -time') 在 PCR 擴增過程中。當(dāng)使用終點 PCR 時，一個簡單的熱循環(huán)儀就足以進行 PCR 擴增和檢測。如果需要實時 PCR，則必須在實時熱循環(huán)儀儀器上進行測定，因為它具有適用于測定的檢測格式，并且還可以檢測已知的 RNA 轉(zhuǎn)錄物或 RNA 中的序列。

在本概述中，我們將重點關(guān)注啟用 RT-qPCR 方法的關(guān)鍵考慮因素和方法，因為這種新技術(shù)為非常流行的應(yīng)用（如基因表達和分子和基因分型分析）提供了一定水平的靈敏和特異性檢測。

儀器功能在 qPCR 檢測結(jié)果中起著重要作用，并且因產(chǎn)品而異。熱穩(wěn)定性、光學(xué)系統(tǒng)和通量形式也會影響您的實驗設(shè)置和過程。

熱穩(wěn)定性

系統(tǒng)在擴增過程中整個板的熱穩(wěn)定性確保您可以在板的所有孔中運行您的測定，包括板周圍的外部孔。在 PCR 擴增過程中不必擔(dān)心邊緣效應(yīng)，使整個過程更高效，移液更少，從而減少浪費。

光學(xué)系統(tǒng)

為了詢問反應(yīng)，實時熱循環(huán)儀必須照亮樣品并檢測產(chǎn)生的熒光。對于一致的強度和光程，確保在所有孔中發(fā)生一致的照明和檢測非常重要。在某些情況下，這可以通過將 LED/檢測器對安裝在掃描板上的梭子上來實現(xiàn)。其他光學(xué)配置，例如使用固定 LED 照亮整個板，在穿梭中使用多個 LED，或使用光纖定位來自固定 LED 的光，可能會導(dǎo)致邊緣或角度效應(yīng)、LED 強度變化、或不同的路徑長度。

吞吐量

根據(jù)檢測設(shè)計和可用樣品數(shù)量，不同孔格式的選擇可能是一個重要的考慮因素。提供 96孔板和 384孔板的產(chǎn)品，可適應(yīng)不同的起始樣品量以滿足不同的應(yīng)用需求。

除了儀器選擇之外，強大的 qPCR 過程還包括檢測設(shè)計。重要的是要考慮如何設(shè)計 qPCR 檢測的每個步驟，從樣品制備到檢測設(shè)計本身。

單一或多重目標(biāo)

檢測設(shè)計包括考慮針對多個目標(biāo)的單重檢測與多重檢測。多重檢測的設(shè)計和優(yōu)化更加復(fù)雜，即使您購買的是商業(yè)檢測，但如果您經(jīng)常使用它們，它們將提供巨大的成本和通量優(yōu)勢。然而，在多重 PCR 中，為 qPCR 反應(yīng)提供穩(wěn)健的預(yù)混液非常重要，該預(yù)混液允許擴增每個靶標(biāo)，減少潛在的污染和樣品間的變異性。

染料與基于探針的檢測分析

qPCR 檢測是否存在擴增的 DNA 可以通過兩種方法測量：基于染料或探針的方法。在理想情況下，隨著 DNA 的擴增，反應(yīng)中存在的擴增子數(shù)量（與初始靶標(biāo)數(shù)量的對數(shù)成正比）將在每個循環(huán)中翻倍。與擴增子數(shù)量成正比的熒光強度也隨之翻倍。

當(dāng)嵌入染料（例如 SYBR 和 EvaGreen）與核酸結(jié)合時，它們會導(dǎo)致核酸發(fā)出熒光，因此可檢測到。它們價格低廉，需要相對簡單的分析設(shè)計來優(yōu)化 qPCR 反應(yīng)。由于染料本身不是序列特異性的，并且會與任何雙鏈 DNA 結(jié)合，因此有必要進行熔點曲線分析，以確保該測定僅擴增了單個產(chǎn)物。

熒光標(biāo)記的探針，例如 TaqMan，依賴于與特定目標(biāo)區(qū)域結(jié)合的序列特異性探針，從而產(chǎn)生熒光。與嵌入染料相比，基于探針的分析更昂貴且設(shè)計復(fù)雜，但是，它們提供了一種特異性，使它們能夠詢問與其他序列非常相似的目標(biāo)。它們也可以多路復(fù)用，允許在單個反應(yīng)中檢測多個目標(biāo)。

試劑選擇和制備

反應(yīng)所需的試劑通常以超級混合物的形式出售，其中包含聚合酶、dNTP、陽離子、緩沖液和其他 PCR 反應(yīng)中常用的添加劑。聚合酶是 DNA 復(fù)制所必需的酶，從原始 DNA 模板產(chǎn)生相同的 DNA 鏈拷貝。

標(biāo)準(zhǔn)的 DNA 聚合酶——已經(jīng)比原來的 Taq 先進得多——足以滿足大多數(shù) qPCR 應(yīng)用。但對于難以擴增的樣品——例如那些具有高 GC 含量、基質(zhì)中抑制劑濃度高、二級結(jié)構(gòu)或長擴增子的樣品——最好使用先進的、高度穩(wěn)健、高度加工的聚合酶工程為目的。

從超混合液制備主混合液可實現(xiàn)一致的試劑混合液，節(jié)省時間，同時減少移液、污染可能性和樣品間變異性。如果適用，使用專門用于基于染料或基于探測的化學(xué)的混合物非常重要。

技術(shù)復(fù)制

一般來說，運行技術(shù)重復(fù)和平均 Cq 值將允許采樣技術(shù)的更好再現(xiàn)性。在以下情況下，這可以看作是有益的：

減少處理低豐度樣品時出現(xiàn)的子采樣錯誤，因為隨著這些目標(biāo)濃度的降低，獲取一致數(shù)量目標(biāo)的能力會降低，從而難以生成準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

測量不確定性還來自樣品中的目標(biāo)量低。在這里，盡管每個移液樣品中可能有相同數(shù)量的靶標(biāo)，但由于反應(yīng)的隨機性，在初始循環(huán)期間只有一部分靶標(biāo)分子被擴增至完成，從而影響后續(xù)循環(huán)作為級聯(lián)效應(yīng)。樣品濃度越低，變異性就越大。

結(jié)論

請注意有關(guān)儀器選擇和分析計劃的這些關(guān)鍵考慮因素，這將使您的 qPCR 分析獲得最可靠的數(shù)據(jù)，從而節(jié)省您的時間和額外的精力。