熱門關(guān)鍵詞: 自動化吸頭 移液器吸頭 PCR管 細(xì)胞培養(yǎng)皿
細(xì)胞培養(yǎng)是生物科學(xué)體外研究不可或缺的一部分。它涉及在人工環(huán)境中培養(yǎng)永生化細(xì)胞系或原代細(xì)胞樣本。這些細(xì)胞可用作一系列不同科學(xué)研究的模型,包括測定藥物或其他化合物對生長、活力和新陳代謝的影響,或用作不同疾病的模型。它們通常用于進(jìn)行體內(nèi)實驗之前的初步研究。
從細(xì)胞培養(yǎng)實驗中得出的結(jié)論的有用性和適用性在很大程度上取決于所進(jìn)行的質(zhì)量控制 (QC)。適當(dāng)?shù)?QC 可以確保細(xì)胞系模型給出可重復(fù)的結(jié)果,并可以自信地得出結(jié)論。忽略細(xì)胞培養(yǎng)中的 QC 可能會使研究人員和實驗室在時間和金錢方面付出巨大的代價,并且來自無法證明適當(dāng) QC 的實驗室的數(shù)據(jù)不太可能被公布。
Nikoleta Daskoulidou 博士是位于卡迪夫的英國癡呆癥研究所的研究員,致力于了解先天免疫在阿爾茨海默病中的作用。作為她工作的一部分,Daskoulidou 博士使用干細(xì)胞技術(shù)作為細(xì)胞模型。她描述了 QC 在她的研究中的重要性:“我認(rèn)為不良的 QC 是缺乏可重復(fù)性和可能無效的研究數(shù)據(jù)的主要原因。對我來說,測試我正在使用的細(xì)胞的特性、純度和表型是非常重要的?!?Daskoulidou 博士提到了她在研究中使用的一些 QC 方法,包括“檢查特定標(biāo)記的表達(dá)(和表達(dá)水平)以及檢測是否存在潛在的三體性”。這對于她研究阿爾茨海默病編碼序列變體的研究尤為重要。
本文將概述細(xì)胞培養(yǎng)中 QC 的四個主要方面,并描述它們是什么以及我們應(yīng)該執(zhí)行它們的原因。
你的細(xì)胞系是你認(rèn)為的那樣嗎?
這聽起來像是一個顯而易見的問題,但不幸的是,作為研究人員,我們不能認(rèn)為這是理所當(dāng)然的。由于多種原因,可以使用以下細(xì)胞:1)來自不同器官;例如,肺與胃腸道,2) 來自不同的癌癥類型,3) 來自不同的生物體,例如小鼠上皮細(xì)胞與人類上皮細(xì)胞。此外,近年來,CRISPR 革命意味著存在大量經(jīng)過編輯的細(xì)胞系,必須密切注意確保親代細(xì)胞系保持分離。在錯誤的細(xì)胞系上進(jìn)行實驗的影響是巨大的。體外工作是一個有缺陷但非常有用的模型系統(tǒng),用于預(yù)測體內(nèi)效果. 例如,如果在藥物篩選過程中使用了錯誤識別的細(xì)胞系,則結(jié)果對進(jìn)一步實驗的適用性就會受到影響。如果將不適當(dāng)?shù)幕衔镉糜隗w內(nèi)研究,這可能會浪費(fèi)資源并且還具有潛在的危險。根據(jù)Clara Forrer Charlier 博士的說法,來自里約熱內(nèi)盧大學(xué)的博士后研究員,STR 分型“對于結(jié)果的可重復(fù)性非常重要,是方法驗證和藥物發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)?!?目前正在研究 DNA 損傷反應(yīng)和基因組不穩(wěn)定性對神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)變性的影響的 Forrer Charlier 博士指出,STR 分型雖然非常重要,但在實驗室和她的實驗室中通?!白龅帽葢?yīng)該做的頻率低”,她確?!霸谑盏郊?xì)胞系后并在多次傳代后定期進(jìn)行”。
據(jù)報道,在所有培養(yǎng)物中,不同細(xì)胞系的污染發(fā)生率約為 20%。當(dāng)細(xì)胞系具有相似的表型(例如形態(tài)和生長速率)時,細(xì)胞識別問題會更加嚴(yán)重。確定您正在培養(yǎng)或接受的確切細(xì)胞類型的主要方法是 STR 分型。STR 分型利用包括不同個體人類在內(nèi)的生物體之間 DNA 的微小差異。力量; 短串聯(lián)重復(fù),發(fā)生在基因組中,是包含串聯(lián)重復(fù)的非編碼 DNA 的一部分。該區(qū)域的 DNA 復(fù)制錯誤導(dǎo)致子 DNA 鏈的重復(fù)次數(shù)增加或減少。在群體水平上,這會導(dǎo)致 STR 基因座上出現(xiàn)許多不同數(shù)量的串聯(lián)重復(fù)。
STR 分型檢查不同 STR 基因座的重復(fù)數(shù)。商業(yè) STR 試劑盒檢查 16-23 個基因座,然后將其與參考數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較,以確定被測細(xì)胞系的身份。匹配的可能性極低,大約為 1 x 10 18 個個體中的 1 個。
STR 分型的最新進(jìn)展包括在整個基因組中包含更多基因座,多達(dá) 27 個,改進(jìn)基因組區(qū)域的直接擴(kuò)增以及更快的 PCR 循環(huán)能力,這可以減少處理時間。盡管如此,對于細(xì)胞系鑒定,該測定放大了牙釉蛋白基因和 17 個位點。STR 分型應(yīng)用的黃金標(biāo)準(zhǔn)由幾家不同的公司執(zhí)行,它們符合 ISO 9001 和 ISO/IEC 17025 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
污染預(yù)防和篩查
除了確保您的細(xì)胞類型如您所想之外,保持細(xì)胞培養(yǎng)物不受污染是 QC 的另一個方面。這對于確??芍貜?fù)和可靠的結(jié)果至關(guān)重要。最常發(fā)生的細(xì)胞培養(yǎng)污染來自細(xì)菌、真菌和支原體。Daskoulidou 博士在她的實驗室的實踐包括“每隔幾周檢查細(xì)胞系中潛在的支原體污染”。這對于支原體來說尤其重要,因為它不能被顯微鏡下的眼睛看到,因此可能很長一段時間都無法檢測到。
利用防止污染的措施以及篩選將最大限度地減少這對實驗的負(fù)面影響。預(yù)防方法包括使用良好的細(xì)胞培養(yǎng)實踐,包括在層流罩中工作,對所用的試劑、塑料器皿和玻璃器皿進(jìn)行消毒,所有這些都可以將污染風(fēng)險降至最低。
篩查包括目測細(xì)胞生長培養(yǎng)基顏色,定期對培養(yǎng)中的細(xì)胞進(jìn)行顯微鏡檢查,對于用顯微鏡無法看到的支原體,應(yīng)定期對細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行檢測。最常見的支原體檢測方法包括微生物培養(yǎng)、熒光染料 DNA 染色和 PCR 以檢測支原體 rRNA 分子。
您是否正確處理您的細(xì)胞培養(yǎng)物?
一旦我們確定我們的細(xì)胞正是我們認(rèn)為的那樣,并且它們沒有微生物污染,QC 的另一個方面就是我們在實驗室中培養(yǎng)細(xì)胞時維護(hù)它們的方式。
細(xì)胞傳統(tǒng)上在一次性塑料瓶中生長;將一定數(shù)量的細(xì)胞放入燒瓶和生長培養(yǎng)基中。
根據(jù)細(xì)胞系的生長速度,3-5 天后,細(xì)胞需要傳代;一些去除并添加新鮮的生長培養(yǎng)基。當(dāng)這已經(jīng)重復(fù)了很多次(精確的數(shù)字取決于細(xì)胞類型),但通常是 15-30 倍時,細(xì)胞應(yīng)該被丟棄,另一批解凍。Daskoulidou 博士評論說,在研究干細(xì)胞等特定細(xì)胞類型時,就她的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞研究而言,“我確保我使用低傳代細(xì)胞。”
利用這些 QC 方法增加了細(xì)胞對不同條件和實驗做出一致反應(yīng)的可能性。未能定期傳代細(xì)胞會導(dǎo)致過度匯合,即對于燒瓶中的給定區(qū)域或生長培養(yǎng)基的量而言,細(xì)胞過多。這會影響生長速度和新陳代謝,這意味著在進(jìn)行實驗時,細(xì)胞可能會做出不同的反應(yīng)。使用具有非常高的傳代數(shù)的細(xì)胞可能意味著細(xì)胞已耗盡、經(jīng)歷衰老、已開始分化或特定亞群生長得更多并主導(dǎo)培養(yǎng)。
除了這些 QC 實踐之外,還可以對細(xì)胞進(jìn)行一些檢查,例如:蛋白質(zhì)表達(dá)、生長速率、活力、形態(tài)。如果其中任何一個發(fā)生改變,則應(yīng)丟棄細(xì)胞,并解凍較低的通道小瓶。
您是否適當(dāng)?shù)貎Υ婧头窒砟募?xì)胞培養(yǎng)物?
除了在生長過程中維持細(xì)胞外,細(xì)胞系儲存和轉(zhuǎn)移的質(zhì)量控制也是必不可少的。這可以分為三個需要 QC 的關(guān)鍵部分:1) 冷凍和解凍過程,2) 儲存,3) 文檔。
當(dāng)不培養(yǎng)細(xì)胞時,標(biāo)準(zhǔn)的儲存方法是儲存在液氮氣相中的冷凍管中。
1 ) 應(yīng)使用正確的冷凍培養(yǎng)基(含 5-10% 二甲基亞砜 (DMSO) 的胎牛血清 (FBS)),并且冷凍應(yīng)緩慢進(jìn)行。這可以保護(hù)細(xì)胞免受晶體形成。相比之下,必須在水浴中快速解凍,細(xì)胞迅速轉(zhuǎn)移到不含 DMSO 的培養(yǎng)基中,以避免 DMSO 造成的損害。
2) 儲存的質(zhì)量控制包括對液氮罐進(jìn)行適當(dāng)維護(hù),定期重新填充和檢查罐密封,以確保恒溫和安全。良好的做法是在不同位置存放幾個小瓶,以確保在一個罐子受損時不會丟失整個庫存。公司或研究機(jī)構(gòu)內(nèi)的細(xì)胞系轉(zhuǎn)移也可能發(fā)生,尤其是在合作期間。確保細(xì)胞活力不受影響的適當(dāng)包裝和轉(zhuǎn)移方法是關(guān)鍵。
3) 對于存儲和轉(zhuǎn)移,以及使用標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)議,QC 必須標(biāo)記和記錄。如果沒有這些,最終可能會得到不是我們認(rèn)為的那樣的細(xì)胞,如上所述浪費(fèi)時間和金錢。Forrer Charlier 博士指出了解您正在冷凍的東西的身份的重要性,并評論說“如果您計劃冷凍細(xì)胞庫,也建議使用 STR 分型?!?適當(dāng)?shù)臉?biāo)記包括使用以下組合標(biāo)記單個細(xì)胞冷凍管:彩色蓋子、貼紙或冷凍安全標(biāo)記筆,表示細(xì)胞系、接收日期、傳代數(shù)和可能已進(jìn)行的任何更改或基因編輯。
您使用的試劑是否標(biāo)準(zhǔn)化?
細(xì)胞系可能會受到它們?nèi)缟纤龅呐囵B(yǎng)和儲存方式以及所使用的試劑的影響。最重要的試劑是細(xì)胞培養(yǎng)基和用于培養(yǎng)細(xì)胞的血清。
不同的細(xì)胞系或細(xì)胞類型需要具有不同成分的細(xì)胞培養(yǎng)基,但它們通常包括葡萄糖、鹽、維生素、氨基酸和許多其他營養(yǎng)素。此外,還需要某種類型的血清,通常是 FBS。
這些試劑成分的差異會改變細(xì)胞系的生長速率、活力和其他特征,因此對此進(jìn)行 QC 是必不可少的。細(xì)胞培養(yǎng)基本身很容易標(biāo)準(zhǔn)化;有許多不同的公司生產(chǎn)和銷售媒體,并將進(jìn)行自己的測試和滅菌。實驗室和研究所也可以在內(nèi)部制備培養(yǎng)基。對于細(xì)胞培養(yǎng)基的制造商和供應(yīng)商,將對每批生產(chǎn)的產(chǎn)品進(jìn)行一系列標(biāo)準(zhǔn)化測試,包括篩查常見污染物。供應(yīng)商將提供一份分析證書,說明培養(yǎng)基無污染,并且是根據(jù)具有設(shè)定制造協(xié)議的配方生產(chǎn)的。
FBS 不是制造的,而是收獲的。因此,批次之間的差異更大,因此需要進(jìn)行更多測試以確保重現(xiàn)性和質(zhì)量控制。FBS 測試的一個關(guān)鍵部分是確定細(xì)胞在不同批次培養(yǎng)時的行為是否存在差異。出于這個原因,最好使用一個批次進(jìn)行一整套實驗。
最終用戶測試不同批次的培養(yǎng)基以識別細(xì)胞表型的任何變異性很重要,因為不同的細(xì)胞類型對配方中的最小變化具有不同的敏感性。該領(lǐng)域的最新發(fā)展包括更深入地檢查細(xì)胞行為以響應(yīng)培養(yǎng)條件,包括基因組篩選、細(xì)胞蛋白質(zhì)組檢查和代謝組學(xué)變化的鑒定。
質(zhì)量控制一直是并且仍然是良好細(xì)胞培養(yǎng)實踐的基礎(chǔ)。它最大限度地減少了實驗之間的可變性,并增強(qiáng)了生成結(jié)果的穩(wěn)健性。此外,隨著頻率的增加,出版期刊需要研究中的 QC 證明才能發(fā)表來自給定實驗室的論文。細(xì)胞系鑒定和鑒定、污染篩查、適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)實踐、儲存和使用標(biāo)準(zhǔn)化試劑都是應(yīng)該定期進(jìn)行的 QC 的重要方面。許多進(jìn)行質(zhì)量控制的技術(shù)早已確立,但如上所述,有許多新的發(fā)展,包括用于 STR 分型和支原體篩選的快速實驗室內(nèi)檢測試劑盒,跟蹤儲存細(xì)胞系的軟件以及樣本和可訪問的組學(xué)篩選工具,以便隨著時間的推移或?qū)π略噭┑姆磻?yīng)對細(xì)胞進(jìn)行更深入的評估。這些新技術(shù)可以實現(xiàn)更準(zhǔn)確的細(xì)胞質(zhì)量檢查或增加將 QC 納入常規(guī)實驗室實踐的便利性。
【本文標(biāo)簽】 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)板 細(xì)胞培養(yǎng)瓶
【責(zé)任編輯】