細(xì)胞培養(yǎng)過程中時常會出現(xiàn)這樣或那樣的問題,別小看細(xì)胞培養(yǎng),里面卻蘊(yùn)含著大學(xué)問.通過與使用者溝通你會發(fā)現(xiàn)很多可以避免的問題發(fā)生,下面對細(xì)胞培養(yǎng)過程中常見的異常原因做個分析解答。

一、培養(yǎng)細(xì)胞不貼壁

可能原因

1.胰蛋白酶消化過度；

2.支原體污染；

3.培養(yǎng)基pH值過堿（NaHCO3分解）；

4.細(xì)胞老化；

5.接種細(xì)胞起始濃度太低或太高。

解決方法

1.縮短胰蛋白酶消化時間或降低胰蛋白酶濃度；

2.分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架或培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物；

3.使用無菌醋酸溶液調(diào)整pH值或充入無菌CO2；

4.啟用新的保種細(xì)胞；

5.調(diào)節(jié)最佳接種細(xì)胞濃度。

 

二、懸浮細(xì)胞成簇

可能原因

1.培養(yǎng)液中含鈣,鎂離子；

2.支原體污染；

3.蛋白酶過度消化使得細(xì)胞裂解；

4.DNA污染。

解決方法

1.用無鈣鎂平衡鹽溶液洗滌細(xì)胞，輕巧吹吸

2.細(xì)胞獲得單細(xì)胞懸液；

3.分離培養(yǎng)物，檢測支原體；

4.DNasel處理細(xì)胞。

 

三、培養(yǎng)細(xì)胞生長緩慢

可能原因

1.由于更換不同培養(yǎng)液或血清；

2.培養(yǎng)液中一些細(xì)胞生長必須成分如谷氨酰胺或生長因子耗盡或缺乏或已被破壞；

3.培養(yǎng)物中有少量細(xì)菌或真菌污染；

4.試劑保存不當(dāng)；

5.接種細(xì)胞起始濃度太低；

6.細(xì)胞已老化；

7.支原體污染。

解決方法

1.比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清支持細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)，讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液；

2.換入新鮮配置培養(yǎng)液，或補(bǔ)加谷氨酰胺及生長因子；

3.用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，丟棄培養(yǎng)物；

4.血清需保存在-10到-20℃。培養(yǎng)液需在2-8℃避光保存。含血清完全培養(yǎng)液在2-8℃保存，需在1周內(nèi)用完；

5.增加接種細(xì)胞起始濃度；

6.換用新的保種細(xì)胞；

7.分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。

 

四、培養(yǎng)細(xì)胞生長不好

可能原因

A、細(xì)胞本身的狀態(tài)

1. 細(xì)胞傳代次數(shù)多，細(xì)胞老化；

2. 細(xì)胞的接種量：接種量過低，細(xì)胞生長緩慢；

3. 細(xì)胞傳代時間過晚：細(xì)胞中毒，影響傳代后的細(xì)胞生長；

4. 胰酶消化時間過長或過短：時間過長，細(xì)胞死亡；時間過短，細(xì)胞未完全分離而成團(tuán)，細(xì)胞死亡；

5. 細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇：慢凍速溶。

B、污染

1. 支原體污染；

2. 霉菌污染。

C、培養(yǎng)基或血清

1. 更換血清或培養(yǎng)基之前未進(jìn)行驗(yàn)證；

2. 選擇的培養(yǎng)基是否合適；

3. 培養(yǎng)基配制是否合適；

4. 培養(yǎng)基配制是否準(zhǔn)確無誤。

D、培養(yǎng)環(huán)境

1. CO2供應(yīng)是否正常；

2. 培養(yǎng)箱或搖床溫度控制是否正確。

解決方法

根據(jù)以上四個方面的可能原因，做出針對性的解決方案

1.注意細(xì)胞的本身狀態(tài)：如傳代次數(shù)，接種量等；

2.避免產(chǎn)生污染（用正規(guī)，合法，可朔源的血清）；

3.要用合適的血清或培養(yǎng)基，最好經(jīng)過驗(yàn)證；

4.注意實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境。

培養(yǎng)細(xì)胞死亡可能原因

1.培養(yǎng)箱內(nèi)無CO2；

2.培養(yǎng)箱內(nèi)溫度波動太大；

3.細(xì)胞凍存或復(fù)蘇過程中損傷；

4.培養(yǎng)液滲透壓不正確；

5.培養(yǎng)液中有毒代謝產(chǎn)物堆積。

解決方法

1.檢測培養(yǎng)箱內(nèi)CO2；

2.檢查培養(yǎng)箱內(nèi)溫度；

3.取新的保存細(xì)胞種；

4.檢測培養(yǎng)液滲透壓；

5.換入新鮮培養(yǎng)液；