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細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識：如何建立細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室

來源： | 發(fā)布日期：2023-11-01 | 瀏覽量：1

細(xì)胞培養(yǎng) 是一種在實(shí)驗(yàn)室中分離和培養(yǎng)感興趣細(xì)胞的技術(shù)。 盡管原理 適用于原核生物和其他真核細(xì)胞 ， 但術(shù)語“細(xì)胞”通常指哺乳動物

在細(xì)胞培養(yǎng)中，動物細(xì)胞從組織切片中分離出來，并在最佳條件下培養(yǎng)，包括溫度、pH 值和二氧化碳與氧氣的比率。 它們以培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子為食。

細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)胞類型

1. 原代細(xì)胞

原代細(xì)胞 是來自已被酶解離或消化的組織切片的個體化細(xì)胞。

非癌性原代細(xì)胞通常生長緩慢。當(dāng)它們增殖至 80% 匯合 時，原代細(xì)胞被傳代培養(yǎng)或傳代 ，以便它們可以繼續(xù)分裂。大多數(shù)原代細(xì)胞都是 有限的 ——它們在傳代培養(yǎng)到衰老前的某一代后可以分裂。 相反，癌原代細(xì)胞可以無限地傳代培養(yǎng)。

原代細(xì)胞被認(rèn)為是起源組織的最接近的代表。 最初，它們的遺傳和表型特性是異質(zhì)的，因?yàn)榻M織切片中的細(xì)胞組成是混合的。 因此，原代細(xì)胞的身份在每次傳代后都會發(fā)生變化。然而，如果一種細(xì)胞類型的生長和增殖率優(yōu)于另一種細(xì)胞類型，則原代細(xì)胞身份可能會變得更加純合。

2. 輔助細(xì)胞

次生細(xì)胞 是在新鮮培養(yǎng)基中經(jīng)過多次傳代和培養(yǎng)的原代細(xì)胞。

通常，次級細(xì)胞是不死的 。當(dāng)定期提供營養(yǎng)物和新鮮培養(yǎng)基時，它們可以無限期培養(yǎng)。 與原代細(xì)胞相比，它們生長快速，并且具有更同質(zhì)的基因型特征，并且在世代中保持一致。然而，二次細(xì)胞在長時間生長時 往往會分化成 異常細(xì)胞。

輔助細(xì)胞比原代細(xì)胞更容易處理。通常培養(yǎng)它們以產(chǎn)生具有相似特性的細(xì)胞群，用于病毒、免疫學(xué)和毒理學(xué)測試。 

3. 細(xì)胞系

細(xì)胞系 是來自已傳代至少一次的聚集 或單層 原代細(xì)胞的細(xì)胞

細(xì)胞系的基因型和表型特性源自其來源的原代細(xì)胞。 它們的身份更加同質(zhì)，因?yàn)?/span> 細(xì)胞  聚集體 和單層 通常代表一組具有相似身份的細(xì)胞。

  • 永生化細(xì)胞系 可以無限增殖。通常，它們源自干細(xì)胞或癌性原代細(xì)胞。 它們也可以通過病毒元件、突變遺傳元件的遺傳轉(zhuǎn)化或與癌細(xì)胞融合來產(chǎn)生。
  • 細(xì)胞株 是特定細(xì)胞系的選定亞群，經(jīng)過基因工程改造 ，具有額外的特征。基因操作的細(xì)胞株稱為 轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。

細(xì)胞系是研究和開發(fā)的首選細(xì)胞，而原代細(xì)胞則用于確認(rèn)研究。 市售細(xì)胞系的例子是來自宮頸癌細(xì)胞（HeLa）的人上皮細(xì)胞系和倉鼠卵巢細(xì)胞系（CHO）。

細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用

細(xì)胞培養(yǎng)使用戶能夠繁殖特定細(xì)胞以進(jìn)行組織再生或獲得細(xì)胞產(chǎn)品，例如基因工程蛋白質(zhì)和減毒疫苗。

此外，細(xì)胞培養(yǎng)可以適應(yīng)測試或研究平臺。例如， 在動物研究和臨床試驗(yàn)之前，在相關(guān)細(xì)胞培養(yǎng)物中對候選化合物進(jìn)行 體外評估。

它篩選化合物毒性和靶細(xì)胞對候選化合物的反應(yīng)，使研究人員能夠僅選擇有希望的化合物進(jìn)行進(jìn)一步測試。 同樣，細(xì)胞培養(yǎng)可用于模擬和證明假設(shè)的基因功能、癌癥、遺傳或病毒性疾病病理學(xué)和發(fā)病機(jī)制 。

建立和維護(hù)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室時要考慮什么

無菌和生物安全實(shí)踐

無菌和生物安全實(shí)踐是運(yùn)行安全高效的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的關(guān)鍵。 無菌操作可保持細(xì)胞培養(yǎng)物無菌，并防止工人和工作區(qū)域受到污染。生物安全實(shí)踐通過減少暴露于可能具有傳染性的細(xì)胞培養(yǎng)物期間的威脅來創(chuàng)造一個安全的環(huán)境。

大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)工作在生物安全級別至少為2 級 (BSL-2) 的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行， 只有經(jīng)過培訓(xùn)的人員才能進(jìn)入工作區(qū)域。對于非傳染性細(xì)胞系來說已經(jīng)足夠了，但對于涉及原代細(xì)胞的工作來說就不夠了。 大多數(shù)涉及原代細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)室工作均在 BSL-3 或 BSL-4 實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，具體取決于潛在風(fēng)險(xiǎn)、相關(guān)療法和疫苗的可用性。

無菌和生物安全實(shí)踐設(shè)備

1.生物安全柜
  • 生物安全柜 又 稱為細(xì)胞培養(yǎng) 、層流罩， 是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的必備設(shè)備。 它提供了一個無菌工作區(qū)域并防止細(xì)胞培養(yǎng)中的污染。
  • II級生物安全柜 是細(xì)胞培養(yǎng)的推薦等級。 它具有內(nèi)置風(fēng)扇和高效微?？諝?(HEPA) 過濾器，可防止細(xì)菌、真菌和病毒顆粒污染細(xì)胞培養(yǎng)物和工作表面。 
  • 使用前后對用于細(xì)胞培養(yǎng)的柜子、設(shè)備、容器和工具內(nèi)的工作表面進(jìn)行消毒。 工作前后用70%(v/v)乙醇等消毒劑擦拭干凈或使用紫外線燈。
2. 高壓滅菌器
  • 高壓滅菌器 在緩沖液、設(shè)備和消耗品接觸細(xì)胞培養(yǎng)物之前對其進(jìn)行滅菌，從而降低污染風(fēng)險(xiǎn)。細(xì)胞培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的廢物應(yīng)在生物危害廢物容器 中分離，并在處置前進(jìn)行高壓滅菌以凈化。
  • 您可以在這里了解有關(guān)高壓滅菌器 和替代滅菌技術(shù) 的更多信息！
3.個人防護(hù)裝備（PPE）
  • 個人防護(hù)裝備 (PPE) 和良好的衛(wèi)生習(xí)慣 是工人抵御有害物質(zhì)威脅的最后一道防線。 建議在進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室之前穿戴個人防護(hù)裝備。 
  • 當(dāng)個人防護(hù)裝備被細(xì)胞培養(yǎng)物污染時，應(yīng)立即將其移除，放入生物危害廢物容器中，或在去污前保存在密閉容器中。 離開實(shí)驗(yàn)室前應(yīng)脫下可重復(fù)使用的個人防護(hù)裝備。

細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備

除了生物安全和無菌操作設(shè)備外，細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室還需要以下設(shè)備： 

  • CO  2 培養(yǎng)箱 為培養(yǎng)細(xì)胞提供增殖環(huán)境。氣套CO  2 培養(yǎng)箱 能夠抵抗溫度波動，使其適合通常處理貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的多用戶細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室 。 對于 懸浮細(xì)胞培養(yǎng) ，  CO  2 搖床培養(yǎng)箱 更合適。 如果您想了解有關(guān)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)箱的更多信息，請閱讀我們關(guān)于 如何 為您的研究/實(shí)驗(yàn)室工作選擇合適的培養(yǎng)箱的文章！
  • 倒置光學(xué)顯微鏡 用于 觀察和記錄細(xì)胞培養(yǎng)容器中的形態(tài)、附著和污染。
  • 血細(xì)胞計(jì)數(shù) 器 是一組顯微載玻片和玻璃，用于根據(jù)采樣細(xì)胞的數(shù)量估計(jì)培養(yǎng)容器中的細(xì)胞濃度。 在許多情況下，采樣的細(xì)胞會用臺盼藍(lán) 和 番紅 等染料染色， 以幫助區(qū)分培養(yǎng)細(xì)胞和污染物。
  • 需要使用溫度可調(diào)的 水浴 或 干浴將細(xì)胞培養(yǎng)基和其他緩沖液加熱至培養(yǎng)溫度。
  • 真空泵 與硅膠軟管和巴斯德吸管連接以吸出細(xì)胞培養(yǎng)基。 真空泵可以用 無菌移液器和 移液器填充器 代替。

此外，細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室還需要微量離心機(jī)、實(shí)驗(yàn)室冰箱、冰柜 等生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室通用設(shè)備。

細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室耗材

細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室中的大多數(shù)耗材都是通用的，除了一些與細(xì)胞培養(yǎng)物接觸的耗材。 塑料耗材和 玻璃器皿的使用和處理方式 與大多數(shù)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室中的類似。

例如：

  • 細(xì)胞培養(yǎng)瓶 是懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的容器。 燒瓶主體由無菌聚碳酸酯或聚苯乙烯塑料制成，形狀為錐形燒瓶或帶有用 實(shí)心蓋或通氣蓋密封的傾斜 頸部的矩形盒子。 后者包含一個疏水過濾器，可以清除容器中潛在的外部污染物，促進(jìn)更好的氣體交換，而不會降低污染風(fēng)險(xiǎn)。
  • 細(xì)胞培養(yǎng)皿 和 平板 是 用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的 培養(yǎng)容器 ，需要均勻平坦且 非疏水性的 表面用于細(xì)胞附著，并且 與細(xì)胞培養(yǎng)兼容的 單層塑料器皿必須經(jīng)過 TC處理， 這意味著表面被改性以變得更加親水 比典型的塑料。
  • 細(xì)胞培養(yǎng)塔 是用于擴(kuò)大 貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的 。 它們還必須經(jīng)過 TC 處理， 以降低容器表面的疏水性。
  • 低溫瓶 和 儲存盒 用于低溫儲存/保存細(xì)胞培養(yǎng)部分。 這些小瓶由聚碳酸酯制成，可以承受長期暴露在液氮中的壓力和霜凍。 大多數(shù)在使用前都是無菌的或可高壓滅菌的。 同樣，低溫儲存盒由類似材料或防水紙板制成，因此可以承受水和液氮。

結(jié)論

細(xì)胞培養(yǎng)是在實(shí)驗(yàn)室中分離和培養(yǎng)動物細(xì)胞的技術(shù)。 它需要專門的設(shè)備，如 II 級柜、CO  2培養(yǎng)箱和倒置顯微鏡。 運(yùn)行和維護(hù)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的關(guān)鍵部分是無菌和生物安全實(shí)踐，可防止污染并為工人創(chuàng)造安全的工作環(huán)境。