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如何培養(yǎng)實驗室的懸浮細胞?

來源: | 發(fā)布日期:2022-11-18 | 瀏覽量:1

眾所周知,實驗室培養(yǎng)的細胞種類可以大致分為貼壁細胞和懸浮細胞兩種,只有極少數(shù)類型細胞同時存在兩種狀態(tài)。

懸浮細胞是指不需要依賴支持物,可在培養(yǎng)基中以懸浮狀態(tài)生長的一類細胞,如淋巴細胞和大部分血液系統(tǒng)來源細胞。(如小鼠白血病細胞WEHI-3, 人白血病細胞K-562, HL-60)。工業(yè)上也有越來越多的貼壁傳代細胞被馴化出來,進行全懸浮的培養(yǎng)。目前在工業(yè)中應(yīng)用的主要有SP2/0、NS0、CHO、BHK和HEK293細胞等,它們主要用于重組蛋白質(zhì)生產(chǎn);在獸用生物制品中常用的傳代細胞主要有采用全懸浮培養(yǎng)的BHK21細胞、MDCK細胞;及借助微載體懸浮培養(yǎng)的Vero細胞、PK細胞、ST細胞、 Marc145細胞等,每種細胞的特性都不同。

懸浮細胞


懸浮細胞“thp-1”200x


一般情況下,懸浮細胞相較于貼壁細胞的處理更加簡單一些,因為懸浮細胞傳代時無須胰酶消化。但這并不意味著懸浮細胞比貼壁細胞好養(yǎng),對新手來說,反而更具挑戰(zhàn)性??偸菚龅礁鞣N各樣的問題:比如,為什么總是出現(xiàn)死細胞和細胞分化;說好了傳代很easy的,結(jié)果會出現(xiàn)分化;養(yǎng)好了凍存復蘇后又出現(xiàn)問題了!

接下來,我們一起探討一下關(guān)于培養(yǎng)懸浮細胞的幾個要點吧~

要點一:足夠的耐心,這是非常必要的  

很多懸浮細胞在剛從凍存狀態(tài)復蘇時活力是相對較差的,此時我們需要有足夠的耐心,等待細胞完成自我修復進入對數(shù)增長期。比如THP-1(人單核細胞白血?。慕鈨龅交謴驼T鲋惩枰?-10天的恢復期;Jurkat,Clone E6-1(人T淋巴細胞白血病細胞)復蘇后也需要5-7天才能恢復到凍存前的狀態(tài)。新手可能會在此期間放棄培養(yǎng),所以,請多一點耐心哦!培養(yǎng)這類細胞也是培養(yǎng)耐心的過程呢!

要點二:接種密度的把握

一般來說,懸浮細胞接種時密度不應(yīng)低于50萬個/ML,很多懸浮細胞有密度依賴,密度低導致的不增殖也是新手常見問題之一。當然,有極少數(shù)細胞在密度高時反而狀態(tài)變差,如W6/32(小鼠B細胞雜交瘤細胞)。因此,培養(yǎng)不了解的細胞前查找相關(guān)資料去掌握細胞特性非常重要,知己知彼,方能百戰(zhàn)不殆嘛!

換液頻率不應(yīng)該被限制得“明明白白”,細胞是活物,在一個連續(xù)培養(yǎng)周期內(nèi),視細胞生長狀態(tài)可分多次添加補充培養(yǎng)基、葡萄糖等特定營養(yǎng)成份,維持細胞良好的生長狀態(tài)。懸浮培養(yǎng)過程中,隨著細胞的增殖,原有培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗,代謝產(chǎn)物的增加,細胞的活率會下降,及時補充營養(yǎng)物質(zhì),使細胞處于一個相對良好的生存環(huán)境。這里就不再贅述,切忌頻繁離心換液。

下面著重聊一聊換液方法:

①離心全換液法?

即通過離心(800-1000rpm,5min)去除全部舊的培養(yǎng)基,更換新鮮培養(yǎng)基。該方法適合“皮實“好養(yǎng)的懸浮細胞換液(如K562),或者當前細胞狀態(tài)良好、密度較高導致培養(yǎng)基消耗較大的情況。此方法的優(yōu)點是換液徹底,能去除部分細胞碎片,但是同樣會對細胞造成一定程度的機械損傷。

②離心半換液法

 即通過離心(800-1000rpm,5min)50%細胞懸液,更換50%體積的新鮮培養(yǎng)基。該方法適合比較“矯情“難養(yǎng)的細胞(如thp-1),或者正在調(diào)整狀態(tài)中、密度較低但碎片較多需要去除的情況。

③沉降換液法

即不使用離心機而是利用重力自然沉降的方法,將培養(yǎng)基與細胞分離,達到全部或部分更換新鮮培養(yǎng)基。但是其有應(yīng)用局限性—只適合能成一定大小細胞團(否則無法自然沉降,只能低速離心)的細胞,尤其是處理依賴細胞聚集才能增殖的細胞時非常值得推薦,如NK-92、NK-92 MI、Jurkat。該方法能在換液過程中最大限度避免離心過程造成的機械損傷,同時保留聚集的細胞團,并且去除細胞碎片也較為徹底。

掌握了以上幾點,再加上一株好的細胞種子,養(yǎng)出“漂亮“的懸浮細胞就指日可待啦!

細胞培養(yǎng)板


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