熱門關(guān)鍵詞: 自動(dòng)化吸頭 移液器吸頭 PCR管 細(xì)胞培養(yǎng)皿
PCR技術(shù)是一種在體外模擬DNA復(fù)制過(guò)程的核酸擴(kuò)增技術(shù)。它主要是重復(fù)三個(gè)循環(huán):高溫變性、低溫退火和延伸,然后將目標(biāo)DNA擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍。 因此,PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度極高。但每一枚硬幣都有兩個(gè)面,PCR技術(shù)最大的缺點(diǎn)是非常容易被污染,極少量的污染就會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性。
一旦發(fā)生實(shí)驗(yàn)室核酸污染,必須停止正常的實(shí)驗(yàn)。然后需要大量的物力和人力資源,直到找到污染源,或者實(shí)驗(yàn)室的清潔度達(dá)標(biāo)。 此外,實(shí)驗(yàn)報(bào)告必須作廢。結(jié)果只有在重新實(shí)驗(yàn)后才可靠。
為了有效避免污染,獲得穩(wěn)定可靠的檢測(cè)結(jié)果,我們?cè)趯?shí)際工作中往往需要采取一定的措施來(lái)預(yù)防或消除污染。
由于試劑容器、容器、水和其他溶液在制備 PCR 試劑的過(guò)程中會(huì)被核酸污染。
半自動(dòng)核酸提取器和全自動(dòng)核酸提取器在提取過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致樣本或核酸模板溢出,污染機(jī)器。或者設(shè)備內(nèi)的垃圾桶清洗不徹底,殘留液體或結(jié)晶揮發(fā)形成氣溶膠,進(jìn)而產(chǎn)生污染。
造成標(biāo)本交叉污染的原因有多種:標(biāo)本采集容器被污染;標(biāo)本放置時(shí)因密封不良而溢出容器;標(biāo)本粘在容器外; 吸入器的污染和空氣中的氣溶膠。特別是,病毒可以通過(guò)氣溶膠或通過(guò)形成氣溶膠擴(kuò)散,造成相互污染。
這是 PCR 中最常見(jiàn)的污染問(wèn)題。常見(jiàn)于擴(kuò)增后需要打開(kāi)或擴(kuò)增后產(chǎn)物處理不當(dāng)?shù)臋z測(cè)。因?yàn)?PCR 產(chǎn)物的拷貝大小遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于 PCR 檢測(cè)的幾個(gè)拷貝的最大值。 因此,極少量的 PCR 產(chǎn)物污染可以形成假陽(yáng)性。
陽(yáng)性參考常用于實(shí)驗(yàn)室操作,而這些陽(yáng)性參考大多來(lái)自某些克隆質(zhì)粒。單位體積中克隆質(zhì)粒的濃度很高,使用不慎極易被污染。
一些實(shí)驗(yàn)室自行克隆質(zhì)粒作為質(zhì)控品。但是,經(jīng)過(guò)制備后,垃圾的處理方法不夠嚴(yán)格,導(dǎo)致質(zhì)控品對(duì)實(shí)驗(yàn)室的污染,進(jìn)而對(duì)標(biāo)本造成污染。
合理分隔實(shí)驗(yàn)室。分區(qū)或分區(qū)操作以下步驟:標(biāo)本處理、PCR反應(yīng)液制備、PCR循環(huán)擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物鑒定等。 此外,應(yīng)特別注意標(biāo)本處理和PCR產(chǎn)物鑒定必須與其他步驟分開(kāi)。
最好劃分為:標(biāo)本處理區(qū)、PCR反應(yīng)液制備區(qū)、PCR循環(huán)擴(kuò)增區(qū)、PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)。并且他們的實(shí)驗(yàn)用品和吸氣器應(yīng)該專門使用。
實(shí)驗(yàn)室使用的紫外線應(yīng)在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行滅菌,以破壞殘留的 DNA 或 RNA。
各實(shí)驗(yàn)區(qū)應(yīng)用醒目的顏色清楚地標(biāo)明不同的設(shè)備和物品,避免不同工作區(qū)域的設(shè)備和物品混在一起。例如,各個(gè)區(qū)域?qū)iT使用的工作服、工作鞋、垃圾桶、拖把、抹布、鋼筆等。
盡可能使用全送全排空調(diào)系統(tǒng)空調(diào)系統(tǒng)。在進(jìn)入各個(gè)操作區(qū)的過(guò)程中,需要嚴(yán)格的單一流向,即試劑制備和儲(chǔ)存區(qū)→樣品制備區(qū)→PCR擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū),不能逆行。
采取以下措施進(jìn)行污染監(jiān)測(cè):建立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照、重復(fù)試驗(yàn)、選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增等,從而采取預(yù)防和消除污染的措施。
準(zhǔn)備含0.5%有效氯的消毒液擦拭設(shè)備表面、臺(tái)面、地板、物品表面、通行箱、門窗,并浸泡設(shè)備內(nèi)的垃圾桶。
酒精對(duì)空氣噴涂是按照自上而下、由內(nèi)而外的原理進(jìn)行的。
用酒精 (75%) 擦拭移液器、八管離心機(jī)、混合搖床和其他小型設(shè)備。
用純凈水擦拭設(shè)備表面、臺(tái)面和地板,并用純凈水沖洗設(shè)備廢罐。